Disfunção mitocondrial nos défices múltiplos das desidrogenases.

Investigador: Hugo Daniel Carvalho de Azevedo Rocha
Instituição: Departamento de Genética – INSA, Porto

Resumo

A β-oxidação mitocondrial representa uma importante fonte de energia durante períodos de jejum e de stress metabólico, caracterizando-se por ser um processo complexo que envolve o transporte de conjugados activados para o interior da mitocondria e consequente remoção sequencial de duas unidades de acetil-CoA. Pelo menos 25 proteínas diferentes estão envolvidas neste processo e deficiências em algumas delas encontram-se na génese do desenvolvimento de doenças humanas [1]. Correlações genótipo/fenótipo são possíveis de estabelecer para os defeitos que afectam a oxidação dos ácidos gordos de cadeia longa [3] [4]. Nestes é possível estabelecer uma certa relação entre as mutações, a actividade residual da enzima, a acumulação de metabolitos e o fenótipo clínico, sendo proposto que a patofisiologia e nestes casos se deve fundamentalmente a uma deficiência na produção de energia, com um contributo comparativamente menor do efeito intoxicante dos ácidos gordos acumulados [3]. No que diz respeito aos defeitos da β-oxidação que afectam a oxidação dos ácidos gordos de cadeia media/curta, a correlação descrita anteriormente não e possível de estabelecer, pois existem doentes com a mesma mutação e com fenótipos completamente distintos. Algumas hipóteses forma propostas no sentido de explicar esta observação e basearam-se na natureza multifactorial destas patologias, assim como na existência de genes/mutações modificadores. É também aceite que a patogénese dos defeitos que afectam os ácidos gordos de cadeia media/curta se baseiam maioritariamente no possível efeito tóxico dos ácidos gordos e/ou proteínas variantes acumulados, mais do que num défice energético [6] [7]. Em todo o caso mais dados são necessários para validar estas hipóteses.
O objectivo global deste projecto é definir as consequências dos défices múltiplos das desidrogenases (défices de ETF e ETF:QO) no proteoma mitocondrial, gerando novos dados que permitam compreender a patofisiologia associada a esta doença metabólica. Para atingir este objectivo vamos estudar células (fibroblastos) de doentes défices de ETF e ETF:QO e efectuar a comparação com um grupo controlo. A abordagem proposta, nunca aplicada a esta patologia, consiste na caracterização do proteoma mitocondrial e submitocondrial a partir de culturas de fibroblastos de doentes e correlacionar as diferenças observadas com a acumulação de metabolitos e dados moleculares.

Referências bibliográficas
[1] Vocley J, Whiteman DA (2002). Defects of mitochondrial beta-oxidation: a growing group of disorders. Neuromuscul Disord. 12(3):235-46.
[2] Kompare M, Rizzo WB (2008). Mitochondrial fatty-acid oxidation disorders. Semin Pediatr Neurol. 15(3):140-9.
[3] Gregersen N, Andresen BS, Corydon MJ, Corydon TJ, Olsen RK, Bolund L, Bross P (2001). Mutation analysis in mitochondrial fatty acid oxidation defects: Exemplified by acyl- CoA dehydrogenase deficiencies, with special focus on genotype-phenotype relationship. Hum Mutat. 18(3):169-89.
[4] Giak Sim K, Carpenter K, Hammond J, Christodoulou J, Wilcken B (2002). Quantitative fibroblast acylcarnitine profiles in mitochondrial fatty acid beta-oxidation defects: phenotype/metabolite correlations. Mol Genet Metab. 76(4):327-34.
[5] Gregersen N, Bross P, Andresen BS (2004). Genetic defects in fatty acid beta-oxidation and acyl-CoA dehydrogenases. Molecular pathogenesis and genotype phenotype relationships. Eur J Biochem. 271(3):470-82.
[6] Gregersen N, Andresen BS, Pedersen CB, Olsen RK, Corydon TJ, Bross P (2008). Mitochondrial fatty acid oxidation defects-remaining challenges. J Inherit Metab Dis. 31 (5):643-57.
[7] Pedersen CB, Kolvraa S, Kolvraa A, Stenbroen V, Kjeldsen M, Ensenauer R, Tein I, Matern D, Rinaldo P, Vianey-Saban C, Ribes A, Lehnert W, Christensen E, Corydon TJ, Andresen BS, Vang S, Bolund L, Vockley J, Bross P, Gregersen N (2008). The ACADS gene variation spectrum in 114 patients with short-chain acyl-CoA dehydrogenase (SCAD) deficiency is dominated by missense variations leading to protein misfolding at the cellular level. Hum Genet. 124(1):43-56.

Deficiência na desidrogenase dos ésteres acil-coenzima A de cadeia média (MCAD):
Caracterização funcional e estrutural de proteínas mutantes.

Investigador: Maria de Fátima Vieira Ventura
Instituição: Met&Gen, iMed.UL / FFUL – Lisboa

Resumo

A deficiência na desidrogenase dos ésteres acil-CoA de cadeia média (MCADD), enzima essencial na beta-oxidacao mitocondrial dos acidos gordos (mFAO) de cadeia média, e considerada o defeito hereditário mais prevalente da mFAO, em especial em descendentes do nordeste da Europa. A primeira manifestação desta doença hereditária autossómica recessiva, pode ser devastadora podendo levar à morte. Por outro lado, pode revelar-se completamente assintomática. A importância de um diagnóstico precoce levou à implementação em muitos países, incluindo Portugal, do rastreio neonatal desta deficiência. Apesar das bases moleculares da MCADD estarem bem estudadas em diversas populações, o perfil mutacional dos doentes em Portugal não é ainda totalmente conhecido. O nosso grupo genotipou recentemente 58 indivíduos MCADD portugueses. À semelhança de outras populações a maioria dos doentes sao homozigóticos para a mutacao c.985A>G no exão 11, traduzida na substituição por um ácido glutâmico do resíduo de lisina 304 da proteína madura (p.K304E). Durante este estudo foram identificadas duas novas substituições, c.503A>T (D143V) e c.12056>T (6377V) ambas em heterozigotia. De modo a se poder inferir o caracter patogénico das alterações encontradas o grupo desenvolveu um sistema de expressão heteróloga que permitiu já expressar, purificar e caracterizar enzimaticamente a forma selvagem da proteína MCAD (hMCADwt). Neste projecto pretende-se avaliar funcional e estruturalmente as duas novas variantes de MCAD. Uma vez que as novas mutações se encontram em heterozigotia com o alelo G985, pretende-se igualmente co-expressar a proteina p.K304E com as outras mutantes e proceder à caracterização dos híbridos obtidos de modo a avaliar a ocorrência de uma eventual complementação interalélica, fenómeno nunca abordado nos estudos publicados relativos à MCADD. Os dados obtidos possibilitarão determinar o efeito causador de doença das novas mutações e caracterizar pela primeira vez formas híbridas da MCAD, o que podera contribuir para uma antecipação do prognóstico da doença levando a uma melhor avaliação do risco e aconselhamento dos doentes e a longo prazo promover o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.